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红外线灭菌器在染色体标本中的应用
发布时间2013-08-12 浏览次数：722
掌握人类外周血细胞培养方法及染色体标本的制备方法。观察人类染色体的形态和数目。
二、实验原理
血液中的T淋巴细胞在体外培养中经一定剂量的植物血凝素（PHA）刺激，可以返幼进行细胞分裂，用秋水仙素积累分裂相，用0.075mol/L-1KCI进行低渗后，经固定、染色，可见到分散的染色体。
三、实验准备
超净工作台、红外线灭菌器（艾本森仪器公司）、无菌注射器（1ml、2ml、5m1）、针头、培养瓶、橡皮塞、75％酒精棉球、离心机、定时钟、试管架、量筒、刻度离心管、冰凉玻片，毛细滴管、恒温水浴锅、RPMI1640、小牛血清、肝素、秋水仙素、植物血凝素（PHA）、固定液（甲醇：冰乙酸为3∶1，现用现配）、0.075mol。L-1KCI低渗液、Giemsa染液、pH6.8磷酸缓冲液、恒温培养箱、吹风机、粗天平、5％NaHCO3、显微镜。
四、实验方法与步骤
（一）接种
取500单位/lml的肝素0。2ml湿润针筒后，取静脉血1～2ml，转动针筒以混匀肝素；随后立即插入灭菌小瓶内，送入超净工作台（消毒、灭菌等略），在红外线灭菌器旁将血液滴入2～3个盛有5ml培养液（4mlRPMIl640、lml小牛血清，5mgPHA，用5％的NaHCO3调pH至7.0～7.4）的培养瓶内，每瓶0.2～0.3ml（7号针头13滴），盖上橡皮塞，轻轻摇动以混匀。
（二）培养
1．将培养瓶放在37℃恒温箱内培养72h。
2．在终止培养前2～4h，将0.01％的秋水仙素1～2滴（7号针头）加入培养瓶内，轻轻摇匀．放回温箱内，继续培养2～4h。
（三）收获
1．用吸管充分吹打瓶壁，吸取培养物移入刻度离心管内，相对离心管平衡后放入离心机，离心8min（1000转/分），吸去上清液，留下沉淀物。
2．低渗处理：加8ml预温（370C）的0.075mol。L-1KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，放回37℃恒温水浴锅中，静置15～20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。
3．预固定：加入固定液1～2ml打匀。
4．再离心：1000转/分离心8min，吸去上清液，留下沉淀物。
5．固定：沿离心管壁加入新配固定液8ml打匀，固定30min。
6．再离心：1000转/分离心8min，弃去上清液，留下沉淀物。
7．再固定：再加入新配固定液8ml，打匀，静置30min。
8．再离心：1000转/分离心8min，弃去上清液。
9．第四次固定：加入新配固定液0.5～lml打匀成细胞悬液。
10．制片：用滴管吸细胞悬液2～3滴，滴在冰水预浸泡的洁净载玻片上，立即用口吹散，在酒精灯上过几次，吹风机吹干或气干。
11．染色：Giemsa染液（原液∶pH6.8磷酸缓冲液为1∶9）染色10min～20min、自来水冲洗、晾干。
（四）镜检
低倍镜下找到分散良好的分裂相后，换高倍镜、油镜、认真观察。
（五）注意事项
1．PHA是体外淋巴细胞培养成败的关键问题，因此，要考虑它的质量和浓度。盐水提取物一般冰冻保存的时间不宜过长，时间长了效价减低。
2．浓度一般用1％～2％，每毫升培养液加0.2～0.4ml；浓度过高可能会导致红细胞凝集。
3．秋水仙素溶液浓度和处理时间。一般终浓度每毫升培养液0.1～0.2μg为宜，作用时间为3～5h，一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系。如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊。
4．培养温度应严格控制在37℃+0.5℃。
5．双蒸水必须用玻璃蒸馏器制备，pH应在6～7之间。
6．低渗步骤为重要，关系到染色体分散的好坏，因此，低渗液浓度与低渗的时间应掌握适当。
7．离心机用水平式的，速度不宜过快。速度太快细胞团不易打散，反之分裂相易丢失；固定液应在临用时新鲜配制，固定一定要彻底、均匀。若打散不够，则细胞在玻片上易集结。
8．若吹打时用力过猛，细胞易破碎，以致染色体数目不完整；培养液的pH值应掌握在7.4土0.1左右，pH值偏酸发育不良，偏碱时细胞出现轻度固缩。
9．玻璃器皿都要十分干净、无酸，所用试剂以分析纯为好。
10．操作过程应保持高度无菌概念，严防细菌和病毒污染；在外周血培养中，PHA对淋巴细胞的作用，个体差异较大。同样方法和条件，分裂相多少及分散情况不一样。因此，若次失败，应充分考虑到这些因素。
（五）预期实验结果及分析
将制作好的片子在油镜下仔细观察，选择较好的分裂相进行照相、剪贴、分组，将照片上的核型进行剪贴，写出实验报告与实验结果。
染色体数目为46XX，（XY）为人类正常核型。若某对染色体少了一条（2n-1），细胞染色体数目为45；或某一对染色体多了一条（2n+1），细胞染色体数目为47；若为两种核型，46，XX/46，XXY称为嵌合体。以上三种为异常核型。